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  j9九游会pKD46是目前应用最广泛的Red同源重组基因敲除载体,其含有低拷贝温度敏感型的复制子oriR101,在30℃时培养时可以正常复制,而高于37℃时会自动丢失,便于质粒的消除。该质粒还含有受阿拉伯糖(araB)启动子调控的exo、bet、gam基因,它们通过L-阿拉伯糖诱导表达,并携带氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记。

  STTM是人工合成的一段短串联靶标模拟物,中间有一段48nt左右的特定核昔酸序列,两端分别有目标miRNA结合位点,每段miRNA结合序列包括3个非互补碱基(CTA),该序列能与目标miRNA结合形成非完全互补双链,从而有效地阻止miRNA与目的基因结合,使miRNA沉默,使目的基因表达量升高(YanetaL,2012)。STTM技术是研究体内miRNA的有效工具,使miRNA的沉默,使miRNA的靶基因表达量升高,该技术已被广泛应用在拟南芥、水稻、番茄、大豆等miRNA的功能研究(Zhangetal.,2017)

  实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)/qRT-PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光标记物,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般用于mRNA转录水平的定量研究、不同样本或基因组中DNA拷贝数的测定、基因芯片结果验证、药效分析等。

  拟南芥(Arabidopsisthaliana)与油菜、萝卜、卷心菜等同为十字花科植物,又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草,广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究,是一种典型的模式植物。拟南芥植株较小、生长周期短(从发芽到开花约4-6周)、结实多(每株可产生数干粒种子)、具有明显的形态特征(利于突变体表型的观察)、基因组较小、遗传操作简便。经过不断的实践,浸花法(floraltip)已成为拟南芥遗传转化最常用的方法。

  实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)/qRT-PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光标记物,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般用于mRNA转录水平的定量研究、不同样本或基因组中DNA拷贝数的测定、基因芯片结果验证、药效分析等。

  CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术,短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球,成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一,成为当今最主流的基因编辑系统。CRISPR-Cas9技术包含两种重要的组分,一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白,而另一种则是具有导向功能的gRNA(guideRNA)。CRISPR-Cas9技术利用一段与靶序列互补的gRNA引导Cas9核酸酶对特异靶向DNA进行识别和切割,造成DNA的双链或单链断裂,然后j9九游会,细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复,即非同源性末端接合(Non-homologousendjoining,NHEJ)或同源介导的修复(Homology-directedrepair,HDR)。

  基因合成是生物学中一项最基本的、最常用的技术。对DNA调控元件、基因、途径乃至整个基因组的合成是验证生物学假设和利用生物学为人类服务的有力工具,与寡核苷酸合成有所不同:寡核苷酸是单链的,所能合成的最长片段仅为100nt左右,而基因合成则为双链DNA分子合成,所能合成的长度范围50bp-12kb。基因合成是用人工方法合成基因的技术,是基因获取的手段之一,相对于从已有生物中获取基因来说,基因合成无需模板,因而不受基因来源限制。

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